Retorno a Florencia

Durante su estancia en Florencia, viajó un año a Roma. En 1502 entró al servicio de César Borgia, duque de Romaña, hijo del papa Alejandro VI. En su calidad de arquitecto e ingeniero mayor del duque, Leonardo supervisó las obras en las fortalezas de los territorios papales del centro de Italia. En 1503, ya en Florencia, fue miembro de la comisión de artistas encargados de decidir sobre el adecuado emplazamiento del David de Miguel Ángel (1501-1504, Academia, Florencia), y también ejerció de ingeniero en la guerra contra Pisa. Al final de este año comenzó a planificar la decoración para el gran salón del palazzo della Signoria con el tema de la Batalla de Anghiari, victoria florentina en la guerra contra Pisa. Realizó numerosos dibujos y completó un cartón en 1505, pero nunca llegó a realizar la pintura en la pared. El cartón se destruyó en el siglo XVII, conociéndose la composición a través de copias como la que realizó Petrus Paulus Rubens.
Durante su segundo periodo florentino, Leonardo pintó varios retratos, pero el único que se ha conservado es el de La Gioconda (1503-1506, Louvre, París), uno de los retratos más famosos de toda la historia de la pintura, también conocido como Mona Lisa, al identificarse a la modelo con la esposa de Francesco del Giocondo, aunque se han barajado varias hipótesis sobre su verdadera identidad. Si algo merece destacarse de forma especial es la enigmática sonrisa de la retratada. Parece ser que Leonardo sentía una gran predilección por esta obra ya que la llevaba consigo en sus viajes.